Vsebina
- Kloniranje DNK: definicija in pregled postopka
- Metoda vektorja plazmidov
- Metoda PCR (polimerazna verižna reakcija)
- Skupaj uporabljamo metode kloniranja plazemskega vektorja in PCR DNA
- Primeri kloniranja DNA za biotehnologijo
- Primeri kloniranja DNK za raziskave
- Primeri kloniranja DNA za gensko terapijo
Možno je klonirati cele organizme, kot so ovce Dolly, vendar je kloniranje DNK drugačno. Za izdelavo uporablja tehnike molekularne biologije identične kopije zaporedij DNK ali posameznih genov.
Z metodami genskega inženiringa identificiramo in izoliramo segmente genetskega koda DNK. Nato kloniranje DNK kopira zaporedja nukleinskih kislin v segmente.
Tako dobljene identične kopije je mogoče uporabiti za nadaljnje raziskave ali za uporabo v biotehnologiji. Kopirani gen pogosto kodira protein, ki je lahko del zdravljenja. Tehnologija DNA, vključno Kloniranje DNK podpira razumevanje delovanja genov in kako genetski zapis človeka vpliva na delovanje telesa.
Kloniranje DNK: definicija in pregled postopka
Kloniranje DNK je molekularni biološki postopek izdelave identičnih kopij segmentov DNK, ki se nahajajo v kromosomih, ki vsebujejo genetski zapis naprednih organizmov.
Proces ustvarja velike količine ciljne sekvence DNA. Cilj kloniranja DNA je ustvariti same ciljne sekvence DNK ali proizvesti beljakovine, kodirane v ciljnih sekvencah.
Obe metodi, ki se uporabljata pri kloniranju DNK, se imenujeta vektor plazmidov in verižna reakcija polimeraze (PCR). V vektor plazmidov metoda, z uporabo DNK se režejo prameni restrikcijski encimi da nastanejo fragmenti DNK, dobljeni segmenti pa so vstavljeni v klonirajoče vektorje, imenovane plazmide za nadaljnje podvajanje. Plazmidi so nameščeni v bakterijske celice, ki nato proizvajajo DNK kopije ali kodirane proteine.
V PCR metoda, segment verig DNK, ki ga je treba podvajati, je označen z encimi, imenovanimi primerov. Encim polimeraza izdeluje kopije označenega dela verige DNK. Ta metoda ne uporablja restrikcijskih encimov in lahko iz majhnih vzorcev proizvede klonirano DNK. Včasih se dve tehnologiji DNK tehnologije uporabljata skupaj, da se v celotno reakcijo vključijo najboljše lastnosti vsakega.
Metoda vektorja plazmidov
Vektor metode se nanaša na plazmid, ki se uporablja za zadrževanje ciljnega segmenta DNK, ki ga je treba klonirati. Plazmidi so majhni krožni prameni nehromosomska DNK najdemo ga v številnih organizmih, vključno z bakterijami in virusi.
Bakterijski plazmidi so vektor, ki se uporablja za vstavljanje ciljnega segmenta DNK v bakterijske celice za nadaljnje podvajanje.
Izbira in izolacija ciljne DNK: Preden se lahko začne postopek kloniranja DNK, je treba določiti zaporedja DNK, zlasti začetke in konce segmentov DNK.
Takšna zaporedja DNK lahko najdemo z uporabo obstoječe klonirane DNK z znanimi sekvencami ali s preučevanjem proteina, ki ga proizvaja ciljno zaporedje DNK. Ko je zaporedje znano, lahko uporabimo ustrezne restrikcijske encime.
Rezanje ciljne DNK z restrikcijskimi encimi: Restriktivni encimi so izbrani tako, da iščejo kodo DNK na začetku in koncu ciljnih zaporedij.
Ko restrikcijski encimi najdejo posebno kodirano zaporedje baznih parov, imenovanih restrikcijska mesta, se pritrdijo na DNK na tem mestu in se navijajo okoli molekule DNK, tako da prekinejo pramen. Izrezani segmenti DNK, ki vsebujejo ciljno zaporedje, so zdaj na voljo za podvajanje.
Izbira vektorja plazmidov in vstavljanje ciljne DNK: Primerni plazmid idealno vsebuje enake zaporedje kodiranja DNA kot veriga DNK, iz katere je bila odrezana ciljna DNK. Krožni pramen DNA plazmida se razreže z enakimi restrikcijskimi encimi, kot so bili uporabljeni za rezanje ciljne DNK.
A Encim ligaza DNA se uporablja za spodbujanje povezovanja segmentov DNK, konci ciljnega segmenta DNK pa so povezani z odrezanimi konci plazmidne DNA. Ciljna DNK je zdaj del krožnega sklopa plazmidne DNA.
Vstavljanje plazmida v bakterijsko celico: Ko plazmid vsebuje zaporedje DNK, ki ga je treba klonirati, lahko dejansko kloniranje poteka s postopkom, imenovanim bakterijska transformacija. Plazmidi se vstavijo v bakterijsko celico, kot je E. coli, celice z novimi segmenti DNK pa bodo začele proizvajati kopije in ustrezne beljakovine.
Pri bakterijski transformaciji se gostiteljske celice in plazmidi inkubirajo skupaj pri telesni temperaturi približno 12 ur. Celice absorbirajo nekatere plazmide in jih obravnavajo kot lastno plazmidno DNK.
Pridobivanje klonirane DNK in beljakovin: Večina plazmidov, ki se uporabljajo za kloniranje DNK, ima geni za odpornost na antibiotike vključena v njihovo DNK. Ko bakterijske celice absorbirajo nove plazmide, postanejo odporne na antibiotike.
Ko kulturo zdravimo z antibiotiki, preživijo le tiste celice, ki so absorbirale nove plazmide. Rezultat je čista kultura bakterijskih celic s klonirano DNK. Tak DNK lahko nato poberemo ali dobimo ustrezne beljakovine.
Metoda PCR (polimerazna verižna reakcija)
Metoda PCR je preprostejša in kopira obstoječo DNK na svoje mesto. Ne potrebuje rezanja z restrikcijskimi encimi ali vstavljanja zaporedja plazmidne DNA. Zaradi tega je še posebej primeren za kloniranje vzorcev DNK z omejenim številom verig DNK. Medtem ko lahko metoda klonira DNK, pa je ne moremo uporabiti za proizvodnjo ustreznega proteina.
Razkrivanje pramenov DNK: DNK v kromosomih je tesno zvit v dvojno vijačno strukturo. Segrevanje DNK na 96 stopinj Celzija v postopku, imenovanem denaturacija naredi molekulo DNK, da se odvije in loči na dva sklopa. Ta ločitev je potrebna, ker je hkrati mogoče klonirati samo en del DNK.
Izbira temeljnih premazov: Tako kot pri kloniranju DNA s plazmidnim vektorjem je treba tudi zaporedje DNK, ki jih je treba klonirati, identificirati s posebnim poudarkom na začetkih in koncih segmentov DNK. Primeri so encimi, ki se vežejo na specifična zaporedja kod DNA in jih je treba izbrati, da označijo ciljne segmente DNK. Pravi prajmerji se bodo pritrdili na zaporedje molekul DNK, da bi označili začetke in konce ciljnih segmentov.
Reakcija, ki se sproži za vezanje prajmov: Rešimo ohlajanje reakcije na približno 55 stopinj Celzija žarjenje. Ko se reakcija ohladi, se prajmeri aktivirajo in se pritrdijo na verigo DNK na vsakem koncu ciljnega segmenta DNK. Primerji delujejo le kot markerji, niti DNK pa ni treba rezati.
Izdelava identičnih kopij ciljnega segmenta DNK: V postopku, imenovanem podaljšekv reakcijo dodamo encim polimerazo, občutljiv na toploto. Reakcija se nato segreje na 72 stopinj Celzija in aktivira encim. Encim aktivni DNA polimeraza se veže na začetnike in med njimi kopira zaporedje DNK. Začetni postopek sekvenciranja in kloniranja DNK je končan.
Povečanje izkoristka klonirane DNK: Začetni postopek žarjenja in razširitve ustvari razmeroma malo kopij razpoložljivih segmentov DNK. Če želite povečati izkoristek z dodatno replikacijo DNK, reakcijo ponovno ohladimo, da ponovno aktiviramo prajmere in jih pustimo, da se vežejo na druge verige DNK.
Nato reakcija s ponovnim segrevanjem ponovno aktivira encim polimerazo in nastane več kopij. Ta cikel se lahko ponovi 25 do 30-krat.
Skupaj uporabljamo metode kloniranja plazemskega vektorja in PCR DNA
Metoda plazmidnega vektorja temelji na številni začetni oskrbi DNK za rezanje in vstavljanje v plazmide. Premalo prvotne DNK povzroči manj plazmidov in počasen začetek klonirane proizvodnje DNK.
Metoda PCR lahko proizvede veliko količino DNK iz nekaj originalnih verig DNK, a ker DNK ne vsadimo v bakterijsko celico, proizvodnja beljakovin ni mogoča.
Za izdelavo beljakovine, kodirane v fragmentih DNK, ki jo kloniramo iz majhnega začetnega vzorca DNK, lahko uporabimo obe metodi skupaj in lahko se dopolnjujejo. Najprej se metoda PCR uporabi za kloniranje DNK iz majhnega vzorca in izdela veliko kopij.
Nato PCR izdelke uporabimo z metodo plazemskega vektorja za vsaditev proizvedene DNK v bakterijske celice, ki bodo proizvajale želeni protein.
Primeri kloniranja DNA za biotehnologijo
Molekularna biologija uporablja kloniranje genov in podvajanje DNK v medicinske in komercialne namene. Bakterije s kloniranimi zaporedji DNK se uporabljajo za proizvodnjo zdravil in nadomeščanje snovi, ki jih ljudje z genetskimi motnjami ne morejo sami proizvajati.
Tipične uporabe vključujejo:
Biotehnologija uporablja tudi kloniranje genov v kmetijstvu, da ustvari nove značilnosti rastlin in živali ali izboljša obstoječe značilnosti. Ko se klonira več genov, se število možnih uporab eksponentno poveča.
Primeri kloniranja DNK za raziskave
Molekule DNK sestavljajo majhen del materiala v živi celici, zato je težko izolirati vplive številnih genov. Metode kloniranja DNK prinašajo velike količine določenega zaporedja DNK za preučevanje in DNK proizvaja beljakovine tako kot v prvotni celici. Kloniranje DNK omogoča izolacijo preučevanja te operacije za različne gene.
Tipične aplikacije za raziskave in tehnologijo DNK vključujejo pregled:
Ko je kloniranih več sekvenc DNA, je lažje najti in klonirati dodatne sekvence. Obstoječe klonirane segmente DNK lahko uporabimo za določitev, ali se novi segment ujema s starim in kateri deli so drugačni. Prepoznavanje ciljnega zaporedja DNK je nato hitrejše in natančnejše.
Primeri kloniranja DNA za gensko terapijo
V genska terapija, je kloniran gen predstavljen celicam organizma, katerega naravni gen je poškodovan. Vitalni gen, ki proizvaja beljakovine, potrebne za določeno delovanje organizma, bi lahko mutiral, spremenil sevanje ali vplival na viruse.
Ko gen ne deluje pravilno, v celici manjka pomembna snov. Genska terapija poskuša gen nadomestite s klonirano različico, ki bo proizvedla potrebno snov.
Genska terapija je še vedno eksperimentalna in le malo bolnikov je ozdravljeno s tehniko. Težave so povezane z identifikacijo enega samega gena, ki je odgovoren za zdravstveno stanje, in dostavo številnih kopij gena v prave celice. Ker je kloniranje DNK postalo bolj razširjeno, se genska terapija uporablja v več specifičnih situacijah.
Zadnje uspešne prijave so vključevale:
Genska terapija je ena najbolj obetavnih aplikacij kloniranja DNK, vendar se bodo druge nove uporabe verjetno razširile, saj se preučuje več zaporedja DNK in določi njihova funkcija. Kloniranje DNK zagotavlja potrebne surovine za gensko inženirstvo v potrebnih količinah.
Ko je znana vloga genov in njihovo pravilno delovanje je mogoče zagotoviti z nadomeščanjem okvarjenih genov, lahko številne kronične bolezni in celo rak napademo in zdravimo na genetski ravni s pomočjo tehnologije DNA.
Sorodne vsebine: