Vsebina
- Kako delujejo odbojniki
- Zahteve odbojnika
- Izbira ustreznega medpomnilnika
- Kako spremeniti pH puferja
- Primeri bioloških puferjev
V celicah in živih organizmih se tekočina, ki obdaja celice in znotraj njih, ohranja pri konstantnem pH. PH v tem sistemu je pogosto ključnega pomena za biokemične reakcije, ki se odvijajo v organizmu. Znanstveniki za preučevanje bioloških procesov v laboratoriju uporabljajo pufre za vzdrževanje pravilnega pH med poskusom. Veliko bioloških puferjev so prvotno opisali Good in sodelavci leta 1966 in se še danes uporabljajo v laboratorijih.
Kako delujejo odbojniki
Pufer je preprosto raztopina, ki vsebuje šibko kislino in njeno konjugirano bazo. Ko dodamo kislino v pufer, ta reagira s konjugatno bazo, pri čemer nastane šibka kislina in težko vpliva na pH raztopine.
Zahteve odbojnika
Zaradi številnih značilnosti je biološki pufer učinkovit. Morali bi biti topni v vodi, ne pa topni ali minimalno topni v organskih topilih. Pufer ne bi smel preiti skozi celično membrano, saj bi to lahko vplivalo na vedenje celice. Puferi morajo biti nestrupeni, ne smejo absorbirati UV-sevanja in naj ostanejo inertni in stabilni med celotnim poskusnim postopkom. Temperatura in ionska sestava ne smeta spreminjati pH ali zmogljivosti puferja.
Izbira ustreznega medpomnilnika
Izbrani pufer mora imeti pKa v območju, ki je optimalno za preučevani postopek. Pufer z višjim pKa je primeren, če obstaja verjetno, da se bo med poskusom zvišala pH, in obratno, če se pričakuje, da bo pH padel. Koncentracije pufra je treba optimizirati, saj imajo koncentracije, višje od 25 mM, boljšo sposobnost puferja, vendar lahko zavirajo celične aktivnosti, kot so encimi. Metoda narekuje tudi, kateri medpomnilnik uporabiti; na primer, pri elektroforezi je primeren pufer z nizko ionsko trdnostjo, ki preprečuje segrevanje matriksa gela.
Kako spremeniti pH puferja
Ker se pH lahko spremeni s temperaturnimi spremembami, morajo znanstveniki preveriti pH puferjev pri temperaturi, pri kateri bodo izvedli poskus. Tris je pufer, ki je še posebej dovzeten za spremembe pH s temperaturo. Vse merilnike pH je treba umeriti pri delovni temperaturi. Dodatki lahko spremenijo tudi pH, zaradi česar je potrebno ponovno testiranje. Za spremembo pH dodamo kislino, običajno klorovodikovo kislino ali bazo, običajno natrijev ali kalijev hidroksid; to je treba storiti počasi, da se prepreči inaktivacija ali kemične spremembe v blažilniku.
Primeri bioloških puferjev
TE pufer, ki je 10 mM Tris · HCl in 1 mM EDTA, je primeren pri številnih pH vrednostih za shranjevanje nukleinskih kislin. Elektroforeza je pogosta metoda za preučevanje beljakovin ali nukleinskih kislin; ta postopek uporablja številne pufre, vključno s pufri Tris-acetat-EDTA, Tris-glicin in Tris-borat-EDTA. Ti puferi preprečujejo segrevanje gel matriksa in lahko vsebujejo dodatke, kot sta sečnina in SDS, odvisno od preiskave.