Vsebina
Pri kemijskih reakcijah, ki jih katalizira encim, encim zmanjša količino potrebne aktivacijske energije, tako da se začasno poveže s substratom in ga zvije v napeto stanje. K (katalizator) ali "kcat" za reakcijo se nanaša na koncentracijsko neodvisno konstanto za hitrost, s katero lahko določen encim presnovi substrat v molekulo produkta. Da bi izračunali kcat, znanstveniki najprej mešajo več epruvet z različnimi koncentracijami substrata (znan kot "encimski test") in jih v stalnih časovnih intervalih preskušajo s svetlobnim spektrofotometrom za merjenje naraščajočih koncentracij molekul izdelka. Ti podatki se nato narišejo na graf in analizirajo.
Izračun začetnih hitrosti
Narišite grafikon koncentracije proizvoda glede na čas za podatke iz prve epruvete z encimskimi preskusi. Opomba: vodoravna os mora biti "čas", navpična os pa "koncentracija proizvoda."
Izračunajte linearno regresijsko črto za podatkovne točke, ki ste jih narisali v 1. oddelku 1. korak. Medtem ko Excel in grafični kalkulatorji zlahka določijo ta linearni model, lahko dobite oceno naklona regresijskih črt z deljenjem razlike v koncentraciji izdelka med sosednjimi podatki točke glede na njihovo časovno razliko.
Zabeležite nagib linearne regresijske črte iz 2. koraka 1. oddelka kot "začetno hitrost reakcije (Vo)." Opomba: v modelu regresijske črte "= m + b" je koeficient "m".
Ponovite korake 1, 2 in 3 za preostale epruvete v testu.
Izračun Vmax
Narišite obratno koncentracijo substrata za vsako epruveto in obratno od njene začetne hitrosti reakcije (iz koraka 4 oddelka 1). Na primer, če bi bila začetna hitrost v epruveti z začetno koncentracijo substrata 50 mikromolarnih (uM) 80 uM / s, bi bili inverzi 1/50 uM za koncentracijo substrata in 1/80 uM / s za začetno hitrost. Opomba: obratna koncentracija podlage mora biti na vodoravni osi, inverzna začetna hitrost pa na navpični osi.
Opomba: koncentracija substrata mora biti na vodoravni osi, začetna hitrost reakcije pa na navpični osi.
Določite linearno regresijsko črto za grafikon, ki ste ga izrisali v koraku 1. oddelka 2. Opomba: ker boste morali poznati y-sečišče za regresijsko črto, morate točke iz oddelka 2, korak 1 vnesti v Excel ali a grafični kalkulator in uporabite vgrajeno funkcijo regresijskega modeliranja.
Razdelite 1 z y-seciščem od linearne regresijske črte. Tako boste dobili vrednost inverzne vrednosti Vmax, največjo reakcijsko hitrost encima. Opomba: če model linearne regresije dobi obliko "= m + b", bi bila vrednost "b" y-sečišče. Razdelite 1 s "b" za izračun inverzne vrednosti Vmax.
Z rezultatom iz koraka 3 oddelka 2 razdelite 1 za izračun dejanske vrednosti Vmax.
Določite koncentracijo encima v prvotnem testu (glejte surove podatke). Opomba: koncentracija encima je enaka za vse epruvete; v preskusu se razlikujejo samo koncentracije substrata.
Vmax (iz oddelka 2, korak 4) razdelite glede na koncentracijo encima (iz oddelka 2, korak 5). Rezultat je vrednost Kcat.