Vsebina
Gensko modra celica je kodirana znotraj njenega genetskega materiala ali DNK. Ker DNK nikoli ne zapusti jedra celice, je treba, da bi ta informacija prišla v citoplazmo, kjer prebivajo drugi proteini in biokemične komponente, najprej prepisati DNK v messenger RNA (mRNA ali poly (A) RNA). Ta mRNA se nato pretvori v beljakovine, ki opravljajo številne funkcije celice. Za odkrivanje ali količinsko določitev zelo redkih mRNK, izdelavo sond za mikroarke ali izdelavo knjižnic komplementarnih molekul DNK mora biti mRNA izolirana. Vendar popolna ekstrakcija RNA (tj. Vsa RNA v celici) in nadaljnja izolacija mRNA nista medsebojno izključujoča se procesa; prvi se mora izvesti, da se mRNA izloči.
Izolacija mRNA iz skupne RNA
Homogenizacija TRIzola: Skupna RNA vključuje vse mRNA, RNA za prenos, ribosomsko RNA in druge nekodirane RNA. Če jih želite ločiti od drugih celičnih komponent, se celica najprej odpre, da sprosti svojo vsebino. To naredijo z resuspendiranjem celic, ki jih olupimo s centrifugiranjem (vrtenje pri velikih hitrostih) v TRIzol reagentu (Life Technologies). Druge različice TRIzola (na primer Ambionov TRI reagent) delujejo podobno.
Skupna izolacija RNA: Za centrifugiranje različnih komponent (beljakovin, DNK, RNA) celice v plasti ali faze znotraj suspenzije se uporablja vrsta centrifugiranja. Zgornja faza rumene barve je sestavljena iz maščobe in se lahko zavrže. Želena faza je obarvana rdeče, vsebuje skupno RNA in se zadrži. Po ekstrakciji fenol-kloroforma in nizu alkoholnih spiranj z uporabo izopropanola in etanola lahko RNA-kalibriramo za izolacijo mRNA. Dodajte zaviralce RNaze, da preprečite, da bi ta encim razgradil skupno RNA.
Ekstrakcija mRNA: Za izolacijo mRNA je običajna uporaba kompleta, saj domači laboratorijski protokoli ne ustvarjajo velikih količin visoko očiščenih mRNA. Komercialni kompleti vključujejo InVitrogen-ov FastTrack 2.0 ali Ambionov poli (A) čisti mRNA izolacijski komplet. Ti osnovni koraki so običajni za take komplete:
a) Zmešajte lizalni pufer z inhibicijo RNaze, ki je na voljo v kompletu, z do 300 mikrolitri skupne RNA.
b) 5 minut segrejte pri 65 stopinjah Celzija in nato eno minuto takoj ohladite vzorec na ledu.
c) Zmešajte to z 0,5M natrijevim kloridom in nato v tem vzorcu popolnoma raztopite Oligo dT (oligodeoksitimidilna kislina).
d) Centrifugirajte ta vzorec in odstranite supernatant, ki ga večkrat operemo v nizu vezivnih in nizko vsebnosti soli v polnilih.
e) Večkrat eluirajte mRNA, dokler ne dobite volumna določenega volumna (npr. 500 mikrolitrov).
f) Eluat oborimo z oborino natrijevega acetata in etanola. Ponovno suspendirajte v do 20 mikrolitrih vode, obdelane z dietilpirokarbonatom (DEPC).
g) Shranjujte pri -80 stopinj Celzija in preverite kakovost in količino s spektrofotometrijo.