Kako analizirati elektroforezo

Posted on
Avtor: John Stephens
Datum Ustvarjanja: 23 Januar 2021
Datum Posodobitve: 6 November 2024
Anonim
Electrophoresis technique: DNA agarose gel electrophoresis
Video.: Electrophoresis technique: DNA agarose gel electrophoresis

Vsebina

Pri gelski elektroforezi se vzorci DNK ali beljakovin ločijo - običajno glede na velikost - z uporabo električnega polja, ki povzroči njihovo migracijo skozi gel. Uporaba elektroforeze z geli je v biomedicinskih raziskovalnih laboratorijih rutinska in se uporablja za odgovore na različna vprašanja, zato resnično ni univerzalen način za analizo rezultatov.

Različne tehnike, kot so npr. Western bloting, Northern blotting in Southern blotting, vključujejo gel elektroforezo.

Če izvajate agarozno gel elektroforezo vzorcev DNK, najpogostejšega postopka, morate običajno narediti vsaj dve stvari: 1) razlikovati nerezane plazmide od vstavkov, narezane plazmide in rezane plazmide in, 2) oceniti velikost različnih Fragmenti DNK s standardno krivuljo Excel ali kalkulatorjem.

Evo, kako to deluje.

    Preverite svoj laboratorijski prenosnik, da ugotovite, kateri vzorci so bili naloženi v katere pasove. Ko ste naložili vdolbinice za svoj gel, bi morali zabeležiti identiteto vsakega pasu / vzorca.

    Določite, kateri pas vsebuje "lestev" standardov DNK. To so drobci znane dolžine; njihova razdalja selitve se lahko uporabi za določitev velikosti vzorčnih fragmentov s standardno krivuljo Excel ali drugim kalkulatorjem.

    S pomočjo ravnila izmerite razdaljo na svoji sliki od vdolbinic do sledilnega barvila, ki bo potovala dlje od katerega koli pasu DNK (z drugimi besedami, na dnu gela). Zapišite to številko - enote, ki jih uporabljate, niso pomembne.

    Izmerite razdaljo na svoji sliki od vodnjakov do vsakega od pasov na "lestvi", nato pa razdaljo razdaljo razmaka, ki ga je prehodil pas za barvanje za sledenje. Ta izračun vam daje relativno mobilnost vsakega pasu.

    Primer: Predpostavimo, da je pas za barvanje sledil prepotoval 6 centimetrov in imamo tri pasove, ki so prevozili 5, 4,5 in 3,5 palca.

    Kakšna je njihova relativna mobilnost? Odgovor: 5, 4,5 in 3,5 delimo na 6, da dobimo relativne mobilnosti 0,833, 0,75 in 0,5833.

    V program preglednice (Excel ali kateri koli drug podoben program, ki ga uporabljate) vnesite relativno mobilnost skupaj z velikostjo vsakega drobca v lestvi v kilobazah.

    Proizvajalec vam da lestvice, ki jih dobavijo, velikost vsakega drobca, zato bi že morali imeti te podatke.

    Podatke graficirajte z relativno mobilnostjo na x in velikost v kilobazah na y.

    Uporabite funkcijo Trendline v programu preglednice, da enačite enačbo s podatki. Ta enačba mora biti enačba moči (npr. X ^ -2) in mora relativno dobro ustrezati podatkom (R-koeficient vsaj 0,9). To ustvari krivuljo in standardno krivuljo Excela.

    Poglejte pasove, ki ustrezajo vašim vzorcem.

    Ne pozabite, da manjši fragmenti DNK potujejo dlje od gela kot veliki fragmenti DNK, zato bodo tisti, ki so najbližje barvi za sledenje, najmanjši. Upoštevajte pa, da če plazmidne (krožne) DNK ne razrežemo, bo postala "prekomerno" ali zvita kot telefonski kabel, kar bo dejansko povzročilo potovanje dlje kot linearna DNK enake velikosti.

    Prav tako bo potoval "vzdevek", ki je bil nepopolno razrezan krajši razdalja od linearne DNK enake velikosti. Posledično ne morete oceniti velikosti nerezanih plazmidov iz vašega gela.

    Ustrezite pasove na vsakem pasu z identiteto vzorca, ki ste ga naložili na ta pas in ugotovite, ali je tisto, kar vidite, tisto, kar bi pričakovali. To bo odvisno od narave vašega eksperimenta.

    Na splošno pa bi, če bi prebavili vstavljeni plazmid z dvema restrikcijskimi encimi, pričakovali, da bo vložek osvobojen plazmida.

    Ker je veliko manjši od plazmida, bi pričakovali, da boste na tem pasu videli dva pasova, enega blizu vrha in drugega blizu dna. Plazmid, prerezan samo z enim restrikcijskim encimom, bi moral tvoriti samo en pas, ki potuje nekoliko dlje kot plazmid, prerezan z dvema restrikcijskima encimoma, vendar nikjer blizu vstavka.

    Izmerite razdaljo od vdolbinic do rezanega plazmida in vstavite trakove s svojim ravnilom. Te številke razdelite na razdaljo, ki jo je prehodilo sledilno barvilo, da bi našli relativno gibljivost vložkov in rezanih plazmidov.

    Priključite relativno mobilnost vložkov in odrezanih plazmidov v enačbo, ki jo je izračunal za vas program preglednic. Ta izračun naj vam da oceno velikosti teh plazmidov.

    Nasveti