Vsebina
Visokozmogljiva tekočinska kromatografija (HPLC) je laboratorijska tehnika, ki se uporablja za ločevanje in identifikacijo spojin. Gre za vrsto kolonske kromatografije, ki se zanaša na različne polarnosti spojin v raztopini, da jih loči. HPLC se razlikuje od standardne kromatografije na koloni, saj uporablja pritisk za hitrejšo silo raztopine skozi kolono in zato daje hitrejše in včasih bolj natančne rezultate. Cilj je ločiti spojine v stolpcu in jih pustiti ločeno.
Previdnost
Zaradi hitrosti HPLC in odvisnosti od različnih polarnosti spojin lahko dve spojini s podobno strukturo in polariteto izstopita iz aparata za kromatografijo hkrati ali skoraj v istem času. To je znano kot zaviranje. Zaradi previdnosti je težko natančno določiti, kakšen delež mešanice je eluiral.
Adsorbirane spojine
HPLC običajno uporablja stekleni stolpec, napolnjen s kroglicami iz različnih materialov. Mešanice, ki jih prisilimo skozi kolono, vsebujejo kemikalije, ki se z različnimi jakostmi vežejo na kroglice. Moč vezave, ki je odvisna od podobnosti v polarnosti, določa, kako dolgo se bo kemikalija vezala na kroglico, preden se sprosti. Nekatere spojine se vežejo tako močno, da se v bistvu nikoli ne sprostijo iz kroglic v koloni in se nikoli ne merijo v raztopini, ki izstopa iz kolone.
Cena
Tipične laboratorijske tehnike ločevanja vključujejo razvoj testa ali metode ločevanja in nato izvajanje tega preskusa za ločitev posameznih spojin iz raztopine. Vendar to običajno povzroči več rešitev, ki jih je treba tudi opraviti, kar vodi k eksponentnemu povečanju zahtevnosti. Čeprav lahko HPLC ta postopek pogosto poenostavi in pospeši, lahko stroški za razvoj HPLC aparata postanejo ogromni. Razvoj HPLC aparata, čeprav veliko učinkovitejši, je veliko dražji kot razvoj drugih testov za ločevanje spojin. Zaradi tega ni veliko finančno izvedljivega za številne majhne zasebne laboratorije.
Kompleksnost
HPLC se ne uporablja samo za ločevanje preprostih spojin, temveč se tudi izolira posebne beljakovine iz celične mešanice. V tem primeru so kroglice v stolpcu običajno obložene s protitelesom, značilnim za beljakovine, ki jih morate zbrati. Proteini vežejo protitelesa, preostalo raztopino pa prepustimo skozi kolono, nato pa beljakovine sprostimo z drugo raztopino in jih zberemo. Za to je potreben visoko usposobljen tehnik, da ves čas spremlja stolpec in poskrbi, da postopek teče točno po načrtih.