Vsebina
Pri delu z visokozmogljivo tekočinsko kromatografijo (HPLC) je dobra kalibracija nujno potrebna za zagotovitev zanesljivih in kakovostnih rezultatov. Ustrezno umerjanje instrumenta HPLC se začne z izdelavo primernega kalibracijskega standarda. V večini primerov je za umerjanje dejansko potreben niz standardov za povečanje koncentracije, da se ustvari tako imenovana kalibracijska krivulja. To je narisana črta in z njo povezana enačba, ki opisuje razmerje med koncentracijo kemikalije, ki se testira, in odzivom detektorja HPLC.
Določite kemikalijo, ki jo želite preizkusiti z uporabo HPLC ("analit"). Na primer, morda želite preizkusiti serijo brezalkoholnih pijač glede vsebnosti fruktoze, v tem primeru bi bila fruktoza analit.
Pridobite količino analitske kemikalije primerne čistosti. Čistost naj bi bila običajno višja od 99%, analit pa bi moral biti kupljen od uglednega podjetja za oskrbo s kemikalijami. V primeru fruktoze bi na primer kupili čisto fruktozo pri prodajalcih kemikalij in ne v trgovini z živili.
Določite največjo in najmanjšo pričakovano koncentracijo analita v vzorcih, ki jih nameravate testirati na HPLC. V primeru brezalkoholnih pijač bi pregledali etikete pijač in določili najnižjo in najvišjo vsebnost fruktoze med pijačami, ki jih boste testirali. Upoštevajte, da se lahko začetni vzorec (brezalkoholna pijača) med pripravo na analizo razredči ali drugače manipulira (odvisno od uporabljene metode HPLC) in tako se lahko spremeni koncentracija analita v vzorcih, ki se dejansko vbrizgajo v HPLC. Upoštevati je treba koncentracijo analita v vzorcih, ki se izvajajo na HPLC.
Določite topilo, v katerem boste raztopili svoj analit, da boste pripravili kalibracijske standarde. To topilo mora biti sposobno raztopiti analit v razmeroma širokem območju koncentracije (vsaj tako visoko kot v vzorcih, ki jih nameravate preskusiti). Prav tako bi moralo biti to topilo podobno "mobilni fazi:" topilo, ki se uporablja za prenašanje vzorcev skozi instrument HPLC.
Izračunajte količino analita, ki je potrebna za izdelavo raztopine "analitskega standarda" analita. To ugotovimo tako, da množimo potrebno koncentracijo osnovnega standarda na želeni volumen. Koncentracija analita v tej raztopini mora biti vsaj 10% višja od najvišje pričakovane koncentracije vzorca. Če je najvišja pričakovana koncentracija fruktoze v vzorcu brezalkoholnih pijač 8 gramov / 100 mililitrov, potem lahko osnovni standard dosežemo do koncentracije 10 gramov fruktoze / 100 mililitrov. Primerna prostornina znaša 500 mililitrov, zato bi bilo potrebno 8/100 ml x 500 ml = 40 gramov fruktoze.
Odtehtajte potrebno količino analita do ustrezne stopnje natančnosti. Pogosto je primerna teža teže v gramih, natančno na eno ali dve decimalni mesti, vendar je za nekatere metode morda potrebna večja natančnost.
Odtehtani analit se prenese v prostorninsko bučko s potrebnim volumnom in doda se želeno topilo v oznako za polnjenje v bučki. Uporaba volumetrične bučke (namesto merilne čaše, na primer) poveča natančnost standardne vrednosti koncentracije. Poskrbite, da se ves analit prenese v bučko; uporabite nekaj topila, da ga po potrebi operete.
Volumetrično bučko zložite in jo nežno pretresite ali obrnite, dokler se analit popolnoma ne raztopi.
Naredite serijo različnih razredčitev osnovnega standarda s prenosom znanih količin osnovnega standarda v prostorninske bučke, s pipetami za natančen prenos, nato dodajte topilo. Najnižja standardna koncentracija mora biti pod najnižjim pričakovanim vzorcem, ki ga je treba analizirati. V primeru brezalkoholne pijače je, če je v vzorcu najnižja pričakovana koncentracija fruktoze 2 grama / 100 ml, potem lahko naredimo 1 gram / 100 ml standarda. To bi dosegli z desetkratnim redčenjem osnovnega standarda. Standardna serija mora vključevati skupno 5 ali 6 koncentracij, zato bodo potrebna dodatna redčenja, da se ustvarijo standardi morda 3, 5 in 8 gramov fruktoze / ml. Zdaj imate vrsto standardnih rešitev, s katerimi lahko umerite HPLC.