Vsebina
Barva po Gramu je različni postopek obarvanja, ki pokaže, katere bakterije so gram-pozitivne ali gram-negativne glede na njihovo barvo. Aceton alkohol je en reagent, ki se uporablja v tem postopku za zagotavljanje diferenciacije barve. Gram-pozitivne bakterije imajo debelo peptidoglikansko plast in obarvajo vijolično, medtem ko imajo gram-negativni mikroorganizmi malo ali nič peptidoglikanske plasti in obarvajo roza.
Primarna madež-kristalna vijolična
Ko je pripravljen diapozitiv vzorca bakterij, kristalno vijolično najprej uporabimo za obarvanje vzorca. Na tej točki bodo videti tako gram-pozitivne kot gram-negativne bakterije vijolične. Običajno kristalno vijolico nanesemo na diapozitiv 30 sekund, preden z vodo speremo vse odvečne madeže. Kristalna vijolična barva se lahko nekoliko oprime peptidoglikanskih plasti, tako da se z vodo ne izpere ves primarni madež.
Mordant-Jod
Nato se jod doda 1 jod vzorcu eno minuto. Deluje kot mordant, ki služi pritrditvi barvil v postopku obarvanja. Jod to funkcijo opravlja tako, da se veže na kristalno vijolico in ustvari netopni kompleks, ki se veliko bolje oprime debele peptidoglikanske plasti, ki jo najdemo v gram-pozitivnih bakterijskih celicah kot samo kristalno vijolične. Po dodajanju joda ni koraka pranja z vodo.
Dekolorizer-alkohol
Kot sredstvo za razbarvanje lahko uporabimo aceton ali etilni alkohol. Alkohol raztopi lipidov, ki jih najdemo v zunanji celični membrani gram-negativnih bakterij, kar omogoča, da se kristalno vijolično-jodni kompleks izteka iz tanjše peptidoglikanske plasti. Alkohol se doda 10 do 20 sekund; nalijemo ga na tobogan, dokler se ves jod ne izpere in odtekanje ni brezbarvno. Na tej točki v postopku po barvanju po Gramu so gram-negativne bakterije brezbarvne, medtem ko gram-pozitivne bakterije še vedno zadržijo kristalno vijolično. Ko je drsnik končan, ga je treba sprati z vodo, da se ustavi učinek razbarvanja.
Protireformacija-Safranin
Nato dodamo safranin za povečanje vidnosti in kontrast brezbarvnim gram-negativnim bakterijam. Zaradi madeža so te bakterije pod mikroskopom videti roza. Ker je madež dodan celotnemu vzorcu, obarva tudi gram-pozitivne bakterije, vendar temnejša od kristalno vijolične skriva svetlejšo safraninsko roza barvo. Ko je vzorec diapozitiva približno minuto zasut s safraninom, se z vodo odstrani odvečen madež, ki se ni nalepil na bakterijske celice.