Vsebina
Ko gre za merjenje dolžine fragmentov DNK, ki so veliko manjši od celic, mikrobiologi potrebujejo trik, najprimernejši pa je gel elektroforeza. Ta metoda se opira na dejstvo, da se fragmenti DNK napolnijo, in je alternativa dražjim metodam, kot je rentgenska kristalografija, ki je bila odgovorna za odkritje dvojne vijačne strukture DNK.
Kako deluje elektroforeza z geli
Ker se molekule DNK napolnijo, na njih vpliva električni tok. Ko jih nastavite v nevtralni gel in postavite tok čez gel, molekule migrirajo proti pozitivni elektrodi (anodi). Ker molekule DNK različnih velikosti nosijo isti naboj, manjše potujejo hitreje, zato ta postopek molekule loči v pasove, ki jih je mogoče primerjati z vzorci znanih velikosti.
Osnovni postopek elektroforeze
Gel je običajno narejen iz agaroze, polisaharida, ki pri segrevanju v puferni raztopini tvori poltrden, rahlo porozen gel. Na enem koncu gel tvori drobne vdolbine, imenovane vdolbinice, kamor raziskovalec postavi preučene vzorce DNK, skupaj z referenčnimi vzorci znane dolžine, imenovani DNK lestev. Dolžine drobcev so bile predhodno določene z drugo metodo, kot je rentgenska kristalografija.
Ko je gel potopljen v prevodno raztopino in se uporabi napetost, se fragmenti začnejo migrirati skozi gel - najprej manjši in večji, počasnejši zadaj. Sčasoma se oblikujejo v spektralne pasove glede na velikost.
Ko se to zgodi, raziskovalec izklopi napajanje, napolni gel z barvilom, ki veže DVA, in vzorce pregleda pod ultravijolično svetlobo. Z uporabo lestve kot referenco lahko raziskovalec določi velikost vsakega odlomkov v vidnem pasu. Vidni so samo pasovi - posamezni fragmenti DNK so premajhni, da bi jih lahko videli.
Določitev dolžine neznanih fragmentov
Verjetno ni vsak pas v vzorcu para z pasom na lestvi, zato znanstveniki za določitev velikosti teh neznanih fragmentov običajno oblikujejo graf. Na osi x je milimeter prevožena razdalja vsakega pasu na lestvi, na osi y pa velikost vsakega pasu. Ko sta točki povezani z krivuljo, lahko velikost katerega koli pasu ekstrapoliramo iz krivulje, če izmerimo razdaljo, ki jo je ta pas prepotoval v milimetrih.