Vsebina
Verižna reakcija polimeraze ali PCR je tehnika, ki en košček DNK fotokopira na številne fragmente - eksponentno veliko. Prvi korak PCR je segrevanje DNK, tako da se denaturira ali topi v posamezne niti. Struktura DNK je kot vrvna lestev, v kateri so vrvi vrvi z magnetnimi konci. Magneti se povezujejo in tvorijo trakove, ki jih imenujemo osnovni pari in se tako upirajo razkopu. Vsak delček DNK se topi v posamezne niti pri različnih temperaturah. Razumevanje, kako se struktura DNK združuje s posameznimi deli DNK, bo omogočilo vpogled, zakaj se različni fragmenti DNK topijo pri različnih temperaturah in zakaj so tako visoke temperature sploh potrebne.
Taljenje! Taljenje!
Prvi korak PCR je taljenje DNK, tako da se dvoverižna DNK loči na enoverižno DNK. Pri DNK sesalcev ta prvi korak običajno vključuje toploto približno 95 stopinj Celzija (približno 200 Fahrenheitov). Pri tej temperaturi se vodikove vezi med baznimi pari A-T in G-C ali trakovi na lestvi DNK razidejo in raztegnejo dvojno verigo DNK. Vendar temperatura ni dovolj vroča, da bi razbila hrbtenico fosfatnega sladkorja, ki tvori enojne niti ali drogove lestve. Popolna ločitev posameznih pramenov jih pripravi na drugi korak PCR, ki se ohladi, tako da lahko kratke fragmente DNK, imenovane primer, vežejo posamezne niti.
Magnetne zadrge
Eden od razlogov, da se DNK segreje na visoko temperaturo 95 stopinj Celzija, je, da dlje kot je dvojni niz DNK, bolj želi ostati skupaj. Dolžina DNK je eden od dejavnikov, ki vpliva na tališče, izbrano za PCR na tem kosu DNK. A-T in G-C baznih parov v dvoverižni DNK se vežejo med seboj, da držijo dvojno strukturo skupaj. Bolj zaporedni osnovni pari med dvema enojnima pramenoma se vežeta, bolj se želijo tudi njihovi sosedi vezati in močnejša postane privlačnost med obema niti. Je kot zadrga iz majhnih magnetov. Ko zaprete zadrgo, bodo magneti seveda želeli, da zadržite in ostanejo zadržni.
Močnejši magneti se tesneje držijo
Drug dejavnik, ki vpliva na temperaturo taljenja, ki jo izberete za vaš DNK, ki vas zanima, je količina baznih parov G-C, prisotnih v tem fragmentu. Vsak osnovni par je kot dva mini-magneta, ki privlačita. Par iz G in C je veliko bolj privlačen kot par A in T. Tako bo kos DNK, ki ima več parov G-C kot drug fragment, zahteval višjo temperaturo, preden se bo stopil v posamezne niti. DNA naravno absorbira ultravijolično svetlobo - na valovni dolžini 260 nanometrov, če smo natančnejši - in enoverižna DNK absorbira več svetlobe kot dvoverižna DNK. Torej merjenje količine absorbirane svetlobe je način merjenja, koliko se je vaša dvojna veriga DNK stopila v posamezne niti. Učinek magnetnih zadrg baznih parov G-C in A-T je tisto, kar povzroči, da je graf absorpcije svetlobe dvoverižne DNK, ki je bil narisan proti zvišanju temperature, sigmoidna, oblikovana kot S in ne ravna črta. Krivulja S predstavlja odpornost na timsko delo, ki jo osnovni pari izvajajo proti vročini, saj se ne želijo ločiti.
Točka na polovici poti
Temperatura, pri kateri se dolžina DNK stopi v posamezne niti, se imenuje njegova temperatura taljenja, ki jo označimo s kratico "Tm". To označuje temperaturo, pri kateri se je polovica DNK v raztopini stopila v enojne niti, druga polovica pa še vedno v obliki dvojnih pramenov. Temperatura taljenja je pri vsakem drobcu DNK različna. V sesalski DNK je vsebnost G-C 40%, kar pomeni, da je preostalih 60% baznih parov As in Ts. Njegova 40-odstotna vsebnost G-C povzroči, da se sesalna DNK stopi pri 87 stopinjah Celzija (približno 189 Fahrenheitov). Zato je prvi korak PCR na sesalski DNK segrevanje na 94 stopinj Celzija (201 Fahrenheit). Le sedem stopinj je vroče od temperature taljenja in vsi dvojni prameni se bodo popolnoma stopili na enojne niti.