Vsebina
Izračun titra za virus je zapleten način, ki pravi, da znanstvenik šteje število virusov v določenem vzorcu. Za izračunavanje titrov virusov znanstveniki okužijo plošče rastočih bakterij z virusnimi raztopinami v različnih koncentracijah in ugotovijo število virusov v prvotni raztopini s štetjem bakterij, ki so umrle zaradi virusne okužbe.
Serijska redčenja
Nataknite rokavice, napolnite 10 posod za gojenje z 9 ml juhe in jih označite z "10 ^ -1", "10 ^ -2", "10 ^ -3" in tako naprej do "10 ^ -10". Te epruvete bodo uporabljeni za serijska redčenja virusov, ki se uporabljajo za izračun titra faga. Ker virusi lahko zrastejo do neverjetno visokih koncentracij, jih morate razredčiti, da jih lahko učinkovito štejemo. Vsaka epruveta predstavlja desetkratno redčenje virusa.
Vzemite 1 ml virusne kulture, za katero želite izračunati fazni titer, in jo s pipeto prenesite v epruveto z naslovom "10 ^ -1". Cev dobro premešamo. To je vaše prvo desetkratno redčenje.
Vzemite 1 ml mešane kulture iz epruvete z oznako »10 ^ -1« in jo z novo pipeto prenesite v naslednjo epruveto z oznako »10 ^ -2«.
Nadaljujte s tem vzorcem, da ustvarite serijsko serijo redčenja. Na koncu boste napolnili 9 epruvet po 9 ml in 1 epruveto po 10 ml. Virusne obremenitve v epruvetah se razredčijo od 10-krat (vaša prva epruveta) ali 100-krat (vaša druga cev) do deset milijard krat (vaša zadnja cev).
Priprava plošč za izračun titra
Vzemite 10 epruvet mehkega agarja triptona in 10 Petrijevih plošč in jih označite tako, da ustrezajo vašim epruvetam za redno redčenje.
Pokrovčke zrahljajte, da se ne vnamejo v vročini, nato pa epruvete z agarjem postavite v čašo vrele vode. To bo agar topilo tako, da ga boste lahko prelili v Petrijeve krožnike.
Epruvete prenesite v vročo vodno kopel, postavljeno na najmanj 45 stopinj Celzija. Tako boste zagotovili, da se vaš agar ne strdi v epruvetah, preden ga boste lahko vlili v Petrijevo posodo.
V svoj agar dodajte dve kapljici bakterijske kulture in nežno premešajte. To so bakterije, ki jih boste ubili, kar vam omogoča, da štejete število virusnih delcev v določeni raztopini.
Dodajte 1 ml vsake serijske razredčitve v njeno epruveto z agarjem, ko so epruvete še vedno v vroči kopeli. Na primer, 1 ml vašega 10 ^ -1 serijskega redčenja mora iti v epruveto z agarjem z oznako "10 ^ -1."
Zmešajte vsako epruveto in nato vsako epruveto nalijte v Petrijevo ploščo z ustrezno etiketo. To bo ustvarilo tanko plast agarja, ki je bil na vsaki plošči inokuliran z bakterijami in virusi. Plošče pustimo, da rastejo čez noč v inkubatorju.
Štetje in izračun titra virusa
Vzemite svoje krožnike iz inkubatorja in jih preglejte. Po celotni plošči bi morali videti oblačna območja, kjer so zrasle bakterije, razen majhnih prozornih lis, imenovanih plaki. Ti plaki so obliži mrtvih bakterij in vsaka plošča predstavlja en virus.
Poiščite ploščo, na kateri je med 30 in 300 plošč in preštejte točno število plošč na tej plošči.
Vzemite število plošč na svojem krožniku in pomnožite z 10. Če bi prešteli 157 plošč, bi dobili 1570.
Število, ki ste ga dobili v prejšnjem koraku, pomnožite z inverzno številko na epruveti za redčenje. Na primer, če ste izbrali ploščo s ploščo 10 ^ -5, bi pomnožili 1570 z 10 ^ 5, da bi dobili 157000000. Ta končna številka je vaš fazni titer in predstavlja število virusov na ml vaše prvotne kulture.